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「十问十答」酵母杂交通关攻略,全方位交流贴
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2021-11-17 18:55

酵母杂交通关攻略

Q:利用去除激活域的转录因子X作为诱饵,筛选到互作蛋白Y。再利用X的全长蛋白导入AD载体,Y导入BD载体,共转AH109的结果显示不互作。怎么解析?

A:这个问题可以从两个方面分析:1.确保第一次共转化验证是否是阳性,用Y2H菌株替换AH109试试,AH109菌株相对更容易产生假阳性;2.确保初次验证是阳性结果,第二次验证是阴性结果,猜测可能是融合的相应的BD和AD的结构域蛋白包裹了诱饵或者猎物蛋白结构域,因为酵母表达系统是真核系统,表达的蛋白是具有结构的非线性的构象,如果蛋白分子量不大,可以采用诱饵和猎物蛋白两次串联方式的构建,或者某个重要结构域重复串联。

Q:如果诱饵可以直接激活报告基因,该如何处理?

A:为保证诱饵蛋白功能的完整性,首先我们会考虑用3’AT/ABA进行背景抑制,但是由于这两种试剂对酵母生长具有较大的毒性,后续可能会影响文库筛选,因此在3’AT超过15mM,ABA超过1200ng/ml时我们会考虑将诱饵蛋白进行截断,通过查阅文献和相关数据库,截去转录激活的区域,需要注意的是,截去的这一部分很有可能会影响到互作结果。

Q:酵母单杂诱饵启动子我该选择全长还是核心区域?

A:全长:优点:更接近于自然条件下的启动环境;缺点:有时候过于长,导致构建具有一定的难度,更可能的产生自激活现象;
预测的核心元件(<20bp):优点:核心元件用于后续的EMSA验证试验,对核心位点进行突变验证启动效果是否减弱,相对全长启动子而言突变的区域较少操作更为方便;缺点:核心元件虽然是启动的核心区域,但是启动子的其他区域也可能是作为辅助元件而存在的,如果缺少这些部分就是非自然条件下的环境,可能产生假阴性;


Q:膜系统功能验证是怎么做?

A:NMY51(PBT3-N-bait+post1-NubaI)此为功能验证组,NubaI为野生型的ubiquitin的N端结构,保留了原始的三个I氨基酸结构,可以在不需要两个蛋白产生相互作用的情况下两个C端和N端的ubiquitin结构域结合在一起产生具有功能的ubiquitin,从而激活下游的报告基因。结论:在二缺平板上正常生长,说明共转化成功,并在缺陷TDO+X-a-Gal的平板上显蓝色说明我们的bait构建的读码框正确(也就是我们构建的诱饵扩谱结构可以满足筛选的需要)。并且我们的ubiquitin系统是存在功能的。

Q:膜蛋白酵母双杂交过程需要注意的问题与细节?

A:膜蛋白的筛选是采用共转化的方式进行的,筛选的假阳性率相对核蛋白的mating方式筛选假阳性率要低一些,但是共转化筛选对转化效率有要求,不然会产生假阴性。如果采用化学转化对感受态转化效率有一定的要求,至少达到10的4次方,感受态细胞的溶氧的提到(装液量不超过1/5)对感受态的效率提高有帮助。电转化感受态保存10%的甘油,转化参数800v,15m转化效率可以到10的5次方到6次方。

Q:请给个预测靶蛋白的网站,植物。

A:domine.utdallas.edu/cgi
string-db.org/cgi/input


Q:相对其他公司而言,金开瑞在酵母杂交业务上具有什么样的优势?

A:从文库构建来说:
文库构建方式灵活:根据样本的类型,提供的样本量等方面考虑,可采用smart,geteway,infusion体外重组和T4体外连接等方式进行文库构建;
文库片段大小可控:根据客户想要研究的蛋白类型大小控制片段的大小,以提高筛选到目标蛋白的可能性。如白细胞介素,生长因子类的小分子蛋白;转录因子,信号通路类的分子量稍大一些的蛋白;
单双杂文库通用:构建一种类型的文库,可同时用于单双杂筛选;

对于文库筛选来说:
筛库方式多样:可采用matting或共转的方式进行文库筛选;
互作强弱可控化:提高(降低)筛选压力,用于筛选出强(弱)相互作用的蛋白。
阳性结果进一步验证:文库筛选出的阳性结果,可进行点对点验证进一步排除假阳性。


Q:酵母杂交年末有活动吗?

A:有,建库、筛库、点对点都有活动,赶紧联系您的对接销售了解详情吧。
 


Q:金开瑞所提到的三框文库和均一化文库具体指什么?与普通文库相比有什么优势吗?

A:三框:氨基酸对应三个密码子,文库中CDNA的片段大小是随机的,读码框也是随机的,例如ATG,有可能是从A开始翻译,也有可能是从T或G开始翻译,这种情况下就只会出现一个正确的读码,三框通过人为的引入一个和两个碱基,使每个移码的基因都能正确的被读出来,这样得到的文库即为一个相对较为完整。

均一化:组织样本中有些基因mRNA含量会很高,而有些基因含量会很低。均一化主要是将高峰度的mRNA通过人为的处理将其在总样本中的占比降下来,这样低丰度的mRNA的占比自然就会升高。如果客户感兴趣的基因恰好属于低丰度mRNA,那么在实现MRNA的均一性后,文库筛选更有可能的筛出客户的目的功能基因。要注意的是均一化不建议用于研究特殊处理后的样本(如,病毒/细菌侵害,水胁迫等)。


Q:进行酵母杂交文库筛选时得到的阳性结果,而进行点对点验证却出现阴性结果,是什么原因造成的呢?

A:可能有以下原因:

1) 酵母杂交本身也是存在假阳性的情况,有可能这两个基因根本不互作,这样在进行单独的点对点验证时自然也不会产生互作;

2) 有些互作为瞬时互作,在文库筛选时可能捕捉导了互作,而在两个基因进行单独验证时由于互作时间的原因,最终导致结果显示为阴性;

3) 有些互作为间接互作,可能需要依靠第三个基因的作用,促进这两个基因的互作。


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